CRISPR/CAS sistem – genski inženiring…razlaga in podrobnosti

//, Novice za zaposlene v zdravstvu/CRISPR/CAS sistem – genski inženiring…razlaga in podrobnosti


CRISPR/CAS sistem – genski inženiring…razlaga in podrobnosti

Deli z drugimi!

V zadnjem čase se v povezavi z genskim inženiringom in urejanjem genoma zelo pogosto uporablja izraz CRISPR. Kljub temu veliko ljudi prave predstave o tem kaj CRISPR pravzaprav je, nima. Danes  bomo nekoliko pobližje spoznali sistem CRISPR in ga vključili v širši okvir uporabe.

KAJ CRISPR JE?

CRISPR je ena od lastnosti, ki definira genski kod bakterije ter njen imunski sistem. CRISPR deluje kot obrambni sistem bakterije, ki ga bakterija uporablja za obrambo pred napadi virusov. Prav tako je prisoten pri predstavnikih kraljestva arhej. Kratica CRISPR v angleščini predstavlja »»clustered regularly interspaced short palindromic repeats« – gre torej za kratke palindromske ponovitve določenih zaporedij znotraj genoma bakterije. V gensko zaporedje imenovano CRISPR, bakterija vgradi DNA zaporedja virusa (vgradnja zaporedja virusa poteka na posebnih območjih imenovanih spacer), ki jo je napadel in si na ta način genski zapis virusa tudi zapomni. Ta metoda bakteriji omogoči zaščito in imunost na določeni virus, v primeru da enak virus poskusi s ponovnim napadom.

V bližini CRISPR zaporedja so še eni geni – tako imenovani Cas geni (s CRISPR povezani geni). Ko se ti geni aktivirajo, omogočijo nastanek posebnih encimov (proteinov), ki so se v evoluciji najverjetneje razvili skupaj s CRISPR. Pomembna lastnost teh Cas encimov je njihova sposobnost delovanja v vlogi »molekularnih škarij«. To enostavno pomeni, da Cas encimi dobesedno režejo DNA molekulo. To pomeni, da v primeru drugega napada virusa na bakterijo, CRISPR regiji, ki od prejšnjega napada virusa nosi informacijo o zaporedju virusa, lahko takoj reže DNA virusa s pomočjo Cas  encimov. Ta »spomin« bakterije torej sproži serijo reakcij, ki Cas encim usmeri k virusu, ta pa ga takoj uniči.

Pri bakterijah obstajajo različni Cas encimi, ki režejo virusno DNA. Za rezanje živalske (in seveda tudi človeške) DNA je najbolj primeren Cas9 encim. Od tod tudi najpogosteje omenjen sistem – CRISPR-Cas9 sistem. Ta sistem znanstveniki in znanstvenice pogosto primerjajo kar s švicarskim nožem – to pomeni, da ima sistem različne funkcije, odvisno od tega, kako ga želimo uporabiti. CRISPR-Cas9 sistem iz bakterij so znanstveniki in znanstvenice nadgradili na način, da koraku, ko CRISPR-Cas9 sistem izreže DNA, sledi korak, ko na novo (prosto) mesto vgradimo »popravljen« gen. Po potrebi pa bi lahko popolnoma izločili gene, ki jih v genomu ne želimo – na primer gene, ki povzročajo bolezni.

Tehnologija CRISPR-Cas9 je že zdaj presegla svoje začetne okvirje – enostavnega urejanja genskih zaporedij oz. genoma. Tako je decembra lani skupina iz Salk Institute uspešno oblikovala CRISPR-Cas9 sistem, ki lahko regulira aktivnost oziroma neaktivnost tarčnega gena, pri tem pa sistem sploh ne posega v gensko zaporedje. Postopek v osnovi poteka tako: 1) najprej se v laboratoriju izdela t.i. vodilna RNA, t.j. del RNA, ki omogoča iskanje tarčnega gena. 2) nato s pomočjo CRISPR-Cas9  »škarij« izrežejo želeno DNA iz zaporedja ter na koncu 3) želen del nove (»popravljene«) DNA vgradijo na želeno mesto.

Takšna tehnologija izgleda obetavna zlasti na področju zdravljenja redkih genetskih bolezni, kjer bi s tarčnim urejanjem genskega zaporedja bolnika, lahko preprečili razvoj take bolezni. Če vzamemo za primer bolnika, ki ima bolezen srpastih celic, ki je posledica mutacije ene same baze v DNA zaporedju njegovega genoma (t.j. DNA). V postopku zdravljenja bi znanstveniki in znanstvenice v laboratoriju oblikovali verigo vodilne RNA, ki je popolnoma enaka kot je mutirana sekvenca DNA. V laboratorijsko mešanico RNA bi nato dodali Cas9 encim. Celotno mešanico RNA in Cas9 bi s pomočjo injekcije vnesli v telo bolnika. Vodilna RNA bi zaradi komplementarnosti zaporedja identificirala mesto mutirane DNA, ki je bolezen povzročila. Cas9 bi nato mesto mutacije izrezal. Izrezano mesto bi nato znanstveniki in znanstvenic zapolnili z zdravo DNA. Rezultat uspešno izvedenega zdravljenja bi moral biti zdrav bolnik, ki ne bi imel več anemije srpastih celic.

ZGODOVINA CRISPR

Odkritje CRISPR ponavljajočih se klustrov (t.j. skupkov) DNA zaporedij se je pojavilo neodvisno v treh delih sveta. Prvi opis zaporedij, ki so jih kasneje poimenovali CRISPR, je podal raziskovalec Ishino Yoshizumi leta 1987. Ishino in sodelavci so v svojem delu omenili ponavljajoče se sekvence pri bakteriji Escherichia coli. Največji premik je naredil Francisco Mojica iz Španije, ki je leta 1993 natančno okarakteriziral danes znani CRISPR lokus. Sama funkcija lokusa je bila definirana komaj leta 2012, od takrat pa je sledil pomemben premik vezan na uporabo CRISPR-Cas sistema v biotehnologiji, genetiki, medicini in kmetijstvu.

V preteklosti so za urejanje genoma uporabljali posebne DNA nukleaze, ki se vežejo na specifična zaporedja genoma živali in rastlin. Med temi so najbolj znane nukleaza zinkovi prsti (ZFN) in transkripcijska aktivatorju podobna efektorska nukleaza (TALEN). Te meganukleaze prepoznajo specifična zaporedja DNA preko protein-DNA interakcij. V splošnem njihova uporaba ni dosegla velikega obsega, saj med proteinskimi ostanki meganukleaze in njihovim tarčnim DNA zaporedjem, ne obstaja dovolj velika specifičnost in z njo povezana natančnost delovanja metode. V letu 2012 pa je te metode nadgradilo molekularno orodje CRISPR/Cas9 sistema.

Do leta 2010, kar je le 3 leta po prvem dokazu obstoja sistema pri bakterijski imunosti, so postale osnovne funkcije in mehanizmi sistema vse bolj jasni. Različne skupine so pričele z raziskovanjem CRISPR sistema za uporabo v biotehnologiji, vključno z razvojem kultur odpornih na fage ter filogenetsko klasifikacijo bakterijskih sevov. V tem času urejanje genoma še ni bilo raziskano.

Moineau in sodelavci so leta 2010 objavili genetsko raziskavo Streptococcus thermophilus, ki je odkrila, da je encim Cas9 edini encim znotraj cas genskega klustra, ki omogoča tarčno izrezovanje DNA: Charpentier in sodelavci so razkrili ključno sestavino biogeneze in procesiranja crRNA v CRISPR sistemu tipa II – to je nekodirajoča trans-aktivirajoča crRNA (tracrRNA), ki hibridizira s crRNA. Na ta način se omogoči RNA-vodena tarčna vezava Cas9. Dvojni RNA hibrid, skupaj s Cas9 in endogeno RNazo III je potrebna za procesiranje CRISPR transkripta v zrelo crRNA. Obe raziskavi kažeta, da so za CRISPR nukleazni sistem tipa II pomembni trije elementi: Cas9, zrela crRNA in tracrRNA. Od tu dalje se je boj za odkritja in napredek na področju CRISPR sistema šele začel.

V zadnjih letih so opravili številne raziskave CRISPR/Cas9 sistema, ki so pokazale, da lahko sistem deluje kot osnova za enostavne in učinkovite metode izvajanja urejanja genskega materiala v bakterijah, kvasovkah in človeških celicah.

Odkritje metod s pomočjo katerih je mogoče izrezovanje, dodajanje ali spreminjanje DNA zaporedij celic ali organizmov, omogoča raziskovanje in natančno določevanje funkcij specifičnih genov in regulatornih elementov. V prihodnosti si lahko obetamo tudi bolj natančno določitev genskih in proteinskih mrež. V biotehnologiji lahko natančna manipulacija elementov genskega materiala ali njegovih regulatornih mehanizmov pospeši povratno inženirstvo ali rekonstrukcijo uporabnih bioloških sistemov, npr. s povečevanjem metabolnih poti proizvodnje biogoriva v industrijsko pomembnih organizmih ali z izdelavo kmetijskih rastlin odpornih na škodljivce in bolezni. Genski inženiring pospešuje novo generacijo razvoja procesov izdelave zdravil in medicinskih terapevtikov. Urejanje genoma bi lahko tako pozdravilo škodljive mutacije v sklopu genske terapije človeka, prav tako pa bi lahko znanje genskega inženiringa razširilo znanje o kompleksnih poligenskih motnjah, ki so posledica hkratne motnje več različnih genov.

Do danes so encim Cas9 iz Streptococcus pyogenes uporabili za dosego učinkovitega urejanja genoma v različnih vrstah in celičnih tipih, vključno s celičnimi linijami človeka, bakterijah, cebricah, kvasovkah, miših, vinski mušici, podgani, različnih žitih, prašičih in opicah. Že zdaj se sistem CRISPR/Cas uporablja pri spreminjanju genomov različnih organizmov – od bakterij, črvov, miši, prašičev pa vse do opic. Sistem bo med drugim omogočil boljše razumevanje želenih genov, npr. genov, ki povzročajo bolezni ali pa npr. izboljšal lastnosti kakšnega kmetijskega pridelka. Pomembno pri tem je dejstvo, da pri uporabi takšne vrste inženiringa ne gre za gensko spremenjen organizem (GSO), saj dejansko v genom ne vnesemo genov drugega organizma.

DELOVANJE METODE

Prokarionti imajo obrambne mrahnizme pred vdori virusnih in plazmidnih celičnih tujkov – podobno kot večcelični organizmi. Imunost s CRISPR je okarkaterizirana z več fazami: prva faza zajema adaptivno fazo bakterije ali arheje – v tej fazi bakterija ali arheja v svoj celični spomin shrani informacije o virusu ali plazmidu, ki je vstopil vanjo. Tako se kratka zaporedja virusnega/plazmidnega genoma vgradijo v CRIPSR lokus genoma bakterije ali arheje. Ta virusna zaporedja vgrajena v bakterijski genom so med sabo ločena s posebnimi zaporedji imenovanimi »spacer«. Znanstveniki in znanstvenice so potrdili, da so prav ta območja tista, ki se pri bakterijah odpornih na določen virus ločijo od zaporedij genoma bakterij, ki na virus niso odporne.

Da bi lahko raziskovalne skupine uporabile CRISPR/Cas mutacije, morajo torej slediti korakom: 1) izbira tarče, 2) tvorba in prenos CRISPR/Cas9 komponent do tarče in 3) identifikacija želene mutacije. To pomeni, da s pomočjo želenih tarčnih zaporedij raziskovalci oblikujejo vodilno RNA (tracrRNA + crRNA), ki se mora usmerjeno (tarčno) vezati na želeno zaporedje genoma, ki ga želijo spreminjati oziroma urejati. Če to zaporedje ni dovolj usmerjeno, se lahko Cas9 veže in reže na napačnem mestu, kar povzroči neželene mutacije v ozadju in lahko vpliva na rezultate poskusa. Prav tako težavo predstavlja vodilna RNA, ki ima lahko zelo različno učinkovitost – kaj na učinkovitost vodilne RNA vpliva, zaenkrat še ni znano, obstajajo pa že osnovni vodniki o tem, kaj učinkovitost vezave vodilne RNA izboljša.

Ko je vodilna RNA enkrat oblikovana, lahko na več načinov vnesemo Cas9 in sgRNA (hibrid tracrRNA in crRNA). Nukleinske kisline (DNA, RNA) in/ali proteine lahko vnesemo s pomočjo mikroinjekcij (pri npr. črvih, vinskih mušicah, cabricah) ali s pomočjo elektroporacije ali transfkecije (kulture sesalčjih celic). Po uspešnem delovanju CRISPR/Cas9 sistema, je potrebno preveriti še pravilnost spremenjenega genoma. Večinoma govorimo o skoraj 100% uspešnost metode urejanja genoma, preverimo pa jo lahko npr. s pomočjo genske selekcije. Pri tem se sproži letalne (smrtne) mutacije, ki omogočijo preživetje le tistih osebkov, ki so pridobili določeno lastnost. To bi npr. pomenilo, da bi kot obliko preverjanja v celico vnesli gen za odpornost proti nekemu zdravilu  – pri tem bi preživeli zgolj tisti osebki, ki bi omenjen gen za odpornost proti zdravilu imeli.

Da bi lahko Cas9 uporabljali kot učinkovit terapevtik, mora Cas9 delati natančne reze, pri tem pa ne sme delati neželeni rezov v genomu, ki ga želimo spreminjati. Da bi specifičnost Cas9 encima povečali, raziskovalci in raziskovalke uporabljajo dva različna Cas9 encima, pri čemer vsak encim reže zgolj na eni verigi DNA. To se doseže z mutacijami katalitičnih domen encima – Cas9 sistem ima namreč dve katalitični domeni, pri tem vsaka domena reže svoj konec DNA. Zelo obetajoče so tudi Cas nukleaze iz bakterij in arhej – nukleaze (podobno kot Cas9 encimi) režejo DNA in pri tem tvorijo »lepljive« konce, kamor se lahko kasneje s pomočjo komplementacije ali ligacije  vgradi želeno zaporedje.

POLEMIKE SPORNOSTI UPORABE METODE

V relativno kratkem času je CRISPR/Cas9 sistem postal orodje za spreminjanje genoma in tvorbo mutacij v različnih organizmih, vključno s človekom. Posledično ima tehnologija velik potencial za zdravljenje bolezni s pomočjo urejanja DNA – tudi pri zdravljenju bolezni pred rojstvom novorojenčka. Tako so Junjiu Huang in njegovi sodelavci na Kitajskem dokazali, da lahko CRISPR/Cas9 sistem za urejanje genoma uporabimo že pri pri zarodku v fazi pred vgnezditvijo. Huang in sodelavci so spremenili gene odgovorne za β-talasemijo, t.j. motnja, katere posledica je anemija krvi. Čeprav je ta eksperiment dokazal, da lahko uporaba metode prepreči številne genske bolezni, je ta raziskava v znanstvenih krogih sprožila številne razprave o etiki genskega inženiringa pri ljudeh. Da bi se tem težavam izgonil, je sicer Huagnova skupina uporabila triploidne zarodke, ki niso imeli možnosti za preživetje. To so dosegli tako, da so eno jajčno celico hkrati oplodili z dvema spermijema.

Kljub temu je večina znanstvenih revij omenjeno raziskavo označila za izredno sporno, posledično njihovih ugotovitev niso želeli objaviti. Zaradi številnih polemik je bilo leta 2015 v Washingtonu (ZDA) posebno srečanje raziskovalcev in raziskovalk iz celega sveta – tema srečanje so bili pogovori o etičnih, znanstvenih in regulatornih težavah, ki so povezani z raziskavami in prakso genskega urejanja pri človeku. Dve leti po objavi Huanga je mednarodna skupina raziskovalcev in raziskovalk potrdila, da se lahko CRISPR/Cas9 sistem uporablja za uspešno urejanje človeških zarodkov, ki kasneje tudi preživijo.

RAZISKAVE SISTEMA PRI LJUDEH

V Švici obstaja podjetje CRISPR Therapeutics, ki je lani sporočilo, da bo skupaj s podjetjem Vertex Pharmaceuticals v letošnjem letu začelo s prvimi kliničnimi raziskavami CRISPR v Evropi. Tarča raziskav bo β-talasemija, pri čemer želijo razsikaovalci in raziskovalke s pomočjo ex vivo metod hematopoetske matične celice bolnika genetsko spreminjati zunaj telesa bolnika. Podjetje je v Evropi že prijavilo fazo I/II, kjer želijo testirati gensko terapijo urejanja genoma CTX001 pri človeku. Druga prijavljena klinična raziskava v ZDA, ki bo prav tako preverjala CTX001 pri drugi krvni motnji imenovani anemija srpastih celic, je prav tako planirana za letošnje leto. CTX001 je prvo od šestih načrtovanih zdravljenj s pomočjo genskega urejanja, ki jih načrtuje podjetje Vertex v sodelovanju s CRISPR Therapeutics.

CTX001 je znana kot ex vivo CRISPR terapija. Metoda urejanja genoma poteka zunaj telesa bolnika. Pri tem se hematopoetske matične celice vzame iz bolnika in se jih v laboratoriju gensko spremeni, da nastanejo rdeče krvničke z visokimi nivoji hemoglobina, ki je sicer prisoten pri zarodku (HbF). Novorojenčki naravno proizvajajo ta protein, ki lažje veže kisik v primerjavi z obliko hemoglobina, ki je sicer prisotna pri odraslih. Novo nastale celice, ki so z genskim inženiringom nastale, nato prenesejo nazaj v bolnika, kjer se z njihovo pomočjo zdravi genske napake oziroma motnje, ki vplivajo na prenos kisika v krvi.

Predklinične raziskave, ki sta jih na dogodku ASH 2017 predstavila CRISPR Therapeutics in Vertex, so pokazale, da je mogoče s CTX001 konsistentno urediti preko 80% človeških hematopoetskih matičnih celic. Te celice, ki so jih nato vnesli v mišje modele rezultira v povečani proizvodnji hemoglobina, ki je sicer prisoten pri zarodku. Rezultate, ki so jih pridobili pri mišjih modelih, želijo preveriti tudi pri ljudeh. Klinične raziskave, ki jih želita izvajati podjetji na ljudeh, sicer niso prve take raziskave na svetu – so pa prve, ki jih finančno podpira gospodarsko podjetje.

Na Kitajskem so že leta 2016 kot prvi pričeli s testiranji tehnologij urejanja urejanja genoma s pomočjo CRISPR/Cas9 na ljudeh. Kitajski onkolog Lu You je tako v telo bolnika s pljučim rakom injiciral  CRISPR. Kitajska ekipa namerava s serijo injekcij zdraviti 10 bolnikov, pri tem skupina poudarja, da je poudarek na varnosti uporabe omenjene metode. Trenutno je namreč zelo nejasno ali lahko pričakujemo resnejše stranske učinke (npr. neželene avtoimunske odzive) metode urejanja genoma. Kitajska je torej prva pri urejanju genoma človeka in urejanja genoma opic s pomočjo CRISPR. Metoda, ki jo uporabljajo Lu in sodelavci, vključuje uporabo vodine RNA, ki omogoča vstop v tarčne celice. Tam se protein Cas9 veže na DNA in jo razreže, kar na koncu privede do popolne odstranitve ali nadomestitve določenega gena z zdravo različico DNA. Delo poteka tako, da se iz prejemnikove krvi najprej odstrani imunske celice, nato se s pomočjo CRISPR/Cas9 onemogoči gene v njih. Spremenjene celice se nato goji, pri čemer se povečuje njihovo število. Nato se jih prenese nazaj v bolnika, ki ima metastato obliko pljučnega raka. Raziskovalci upajo, da bodo spremenjene celice (brez PD-1) napadle in uničile tumor.

Pod stalnim nadzorom etičnih in regulatornih komisij so Ma in sodelavci s sistemom uspešno uredili zarodek, ki je bil heterozigot za mutacijo MYBPC3 gena. Mutacija tega gena povzroči hipertrofično kardiomiopatijo, ki lahko povzroči nenadno smrt človeka, ki ima mutacijo tega gena.

Dva glavna pristopa, ki bi se lahko uporabljala pri terapijah genoma človeka sta ex vivo gensko urejanje ter in vivo gensko urejanje. Ex vivo urejanje genoma vključuje odvzem človeških celic, ki se jih nato gensko uredi v laboratoriju in »popravljene« vrne nazaj v telo bolnika. Metoda je primerna predvsem zato, ker omogoča boljši nadzor samega procesa, glavni problem pa predstavlja predvsem cena metode. Metoda je namreč izrazito individualna in odvisna od bolnika. Pri drugi in vivo metoda pa CRISPR/Cas9 sistem vnesemo v telo bolnika, pri čemer sistem DNA uredi neposredno v celici bolnika. CRISPR lahko v telo vnesemo znotraj različnih nanodelcev ali zakodirane v obliki DNA. Ko je »misija« sistema opravljena, sistem enostavno izločimo iz telesa.

Glavni vprašanji, ki se pojavljata v povezavi z uporabo genskega inženiringa sta torej vprašanje varnosti uporabe ter vprašanje etike uporabe metode pri človeku. V prihodnosti bo potrebno jasno odgovoriti tudi na ti dve vprašanji – tako na strokovni ravni, kot tudi zakonodajni.

Avtorica: Mojca Strgar, univ.dipl.biol. (UN)

Literatura:

CRISPR Therapeutics Plans First CRISPR/Cas9 Clinical Trial in Europe for 2018

https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/bmb.21108

A Review of CRISPR-Cas9: How is the Gene Editing Tool Changing the World?

https://www.nature.com/news/crispr-gene-editing-tested-in-a-person-for-the-first-time-1.20988

2018-05-04T08:39:06+00:00